肺癌作为全球最高致死原因的癌症，在2018年世界卫生组织发布的数据里，成为造成960万患者去世的病因。尽管近几十年来，肺癌的诊断和治疗都有了突出的进展，但相比乳腺癌、甲状腺癌等癌种，预后仍然不容乐观。肺癌早期患者（局部病灶）的五年生存率为55%，而出现远处转移的晚期患者仅有4%。

由于观念、筛查手段的便捷性和技术限制等问题，肺癌早筛早检仍需更加有效、便捷的方法。

随着二代测序（NGS）技术的不断发展，循环肿瘤DNA（ctDNA）的突变检测在肺癌的诊断、监测和预后中，体现了强大的应用前景。而在肿瘤早筛早检领域，目前，早期肿瘤的检测空间依然局限在ctDNA含量非常丰富的癌种，例如肝癌（早期肝癌中位ctDNA含量>10%）。而肺癌，尤其是非小细胞腺癌，早期的ctDNA远低于0.1%：

早期患者的10ml血液里，即使在超深测序（>10,000X），有效分子数通常也<4000个，加上抽样误差和测序错误带来的背景噪音，业内称为“observation dilemma”（观测次数困境），都令实现对超低丰度ctDNA的检出充满困难。

为了突破低频基因突变的瓶颈，燃石研发团队在各种早期肿瘤标识物中，采用了DNA甲基化作为突破口。和肿瘤基因突变相比，DNA甲基化具有如下特点：

(1) 是肿瘤早期发展的标志性改变；

(2) 特征位点众多，而且在基因组上有“成簇”效应；

(3) 具有特异的“图案”和“水平”，增加信噪比；

(4) 具有器官特异性，使肿瘤发生位置溯源成为可能。

这些特质使得表观组学的研究，成为肿瘤早期发现的强大潜力标识。

正在举行的2019年AACR年会，燃石壁报为参会专家展示了ELSA-seq，一种燃石开发的超敏感ctDNA甲基化分析方法用于肺癌早筛探索的研究数据。本次研究燃石与UC Berkeley、北京协和医院和上海胸科医院合作，结果显示：

以单碱基分辨率捕获肿瘤相关表观遗传学改变，用于肺癌早期无创检测具有令人兴奋的应用前景！   

基于ELSA-seq方法，最少仅需1ng的游离血浆 DNA（cfDNA），便可以成功制备足够的单碱基分辨率的测序文库。燃石根据公共数据库的挖掘（肿瘤=4772，正常=411，白细胞=656）和燃石内甲基化组测序数据库的结果，筛选出代表性的80,637个肺癌和泛癌种的差异性甲基化位点（DML）设计重叠捕获探针，探测血液中肿瘤相关甲基化变异。

高效准确的ssDNA建库和靶向捕获，奠定了ELSA-seq超深甲基化测序的基础——在6,000X的中位测序深度下，有效测序量依然攀升，使得针对低频信号的抽样误差、PCR扩增以及测序的错误的有效矫正成为可能。

燃石研发团队对ELSA-seq设计了详细的性能分析（analytical performance），在模拟数据中，ELSA-seq检测敏感性达到0.00001（10万分之1），在肿瘤细胞掺比试验中，多个操作者多次重复，敏感性依然稳定达到0.0005（万分之5）。和传统抗体捕获，或者酶切型甲基化测序比较，ELSA-seq更表现出了可喜的可重复性。

为了验证该方法的临床有效性(clinical validation)，研究者将ELSA-seq应用于两个独立的队列，共398名早期肺癌患者(78%为I期患者)，和501名健康个体:

• 来自中心1的队列：随机分成训练组（n=314）和holdout验证组（n=309）；
• 来自中心2的独立测试组：样本收集、处理以及数据分析完全独立，病理结果直到分析结束才被给出。

在本研究中，针对I/II/III期的非小细胞肺癌患者和健康人群，达到了64%、80%和87%的敏感性，96%的特异性，显著优于目前报道过的基于血液的肺癌早筛平台。

这也是国内外针对肺癌早期患者最大的ctDNA甲基化超深测序队列。

图A. 训练样本集检测结果（左）和ROC曲线（右），n=314

训练集的AUC=0.93（95% CI：0.88，0.95），显示了有效的模型训练。

图B. 验证样本集检测结果（左）和按病理分期分组的各样本的预测概率（右），n=309

Holdout验证集的分类效果近似，而且预测概率随着肿瘤stage进展而不断升高，符合生物学特征，显示了模型对feature的准确模拟和对overfitting的有效控制。 

图C. 独立测试组检测结果（左）和部分患者基因突变检测结果（>10,000X）平行比对（右）

在具有足够血浆的28个早期肺癌患者中，进行了甲基化和体细胞突变的双重检测，ELSA-seq成功检出27个病患（27/28），其中16个有明确的体细胞突变检出，再次验证了甲基化超深测序的高灵敏性。

ELSA-seq在双中心临床验证的结果表明（n=899）：早期肺癌在血浆中的信号可以被超深甲基化靶向测序捕获，大样本训练后的机器学习模型准确性和可泛化性良好，预示着在临床环境中使用的巨大潜力。

燃石研发副总监 李冰思

从科学研究到临床产品需要走过一条漫长的验证之路，燃石的研发与医学团队将继续进行基于DNA甲基化的肿瘤早筛产品的开发、优化与大队列临床验证。希望在不久的未来，更好的检测技术可以开始把肿瘤早诊早筛带入新时代。

关于AACR年会

AACR年度每届都会涵盖癌症研究领域的最新发现——从大众科学到疾病预防、癌症生物学、转化和临床研究——并会展示世界各地研究和医学机构的卓越工作成果。