食管癌（Esophageal cancer，ESCA）是世界范围内死亡率最高的癌种之一，由于早期患者没有特异性症状，约40%的食管癌患者在诊断时已进入晚期，5年生存率不足5%^[1-2]。因为中国人独有的饮食习惯，如高温饮食、腌制食品等，食管癌的发病率显著高于世界上其他国家^[3]。

目前，内镜检查是诊断食管癌的金标准，但针对普通人群，仍缺乏推荐的标准食管癌筛查方法。一方面是发现即晚期、预后差、5年生存率极低的局面，一方面是缺乏有效的筛查手段，使得延长食管癌患者生存期面临着双重困境。因此，开发一种无创或微创，适用于大规模人群早筛早检的食管癌早期检测方法势在必行。

近日，燃石医学泛癌种早检技术ELSA-seq在食管癌中的验证数据正式在BMC Medicine（影响因子：8.775）发表。燃石医学与广东省人民医院胸外科乔贵宾主任、郑州大学第一附属医院胸外科齐宇主任和重庆大学肿瘤医院辇伟奇主任的专家团队合作，显示了基于ELSA-seq平台的cfDNA甲基化检测技术可有效区分食管癌与健康个体和良性食管疾病，并具有良好的敏感性和特异性，该研究中的数据为ELSA-seq平台早期版本的性能，为更大范围的前瞻性临床研究和未来的临床应用奠定了基础。

图1. BMC Medicine文章发表截图

多中心病例对照研究设计

ELSA-seq依靠分子生物学和生物信息学的设计呼应，在上游实现了极少量的血浆中游离DNA的高效回收和利用，在下游致力于信噪窗口分离，在食管癌中究竟会有怎么样的表现？作为一项多中心病例对照研究，本研究通过四阶段的研究设计对这个问题进行了探索。

图2 研究流程图

（1）panel设计，通过TCGA，GEO的公共数据以及内部的数据，共获得了161,984个癌症相关的CpG位点，基因组长度约2.7Mb，覆盖了包括肺癌、食管癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌、卵巢癌在内的六种常见癌症；（2）食管癌特异性标记物选择，研究收集了来自广东省人民医院的24例食管癌患者的肿瘤和癌旁组织，并用上述panel进行分析。根据CpG位点的共甲基化水平和相邻CpG位点的基因组距离将CpG位点分组为921个食管癌特异性的甲基化区域（differentially methylated regions，DMR）；（3）模型开发，包含训练集和测试集；和（4）模型独立验证队列。

ELSA-seq可显著区分癌症与对照样本，

并具有良好的敏感性和特异性

为进一步确认研究定义的921个食管癌特异性DMRs是否可以区分食管癌患者与健康人群和食管良性疾病人群，研究纳入了2019年2月至2019年12月期间，来自广东省人民医院病理诊断为食管癌和良性食管疾病患者的血液样本，和2019年9月至2019年12月期间重庆大学肿瘤医院的健康人对照组血液样本。参与者按年龄匹配，随机进入训练和测试集，最终分别各有110名参与者被纳入训练集和测试集。

图3.训练集（左）和测试集（右）中食管癌、良性食管疾病和健康对照者之间DMR区域的cfDNA甲基化水平热图

研究发现，食管癌、良性食管疾病和健康对照者之间的甲基化模式具有显著差异（图3）。在纳入机器学习模型进行交叉验证后结果如下（图4）：

1. 在训练集和测试集中，预测的概率随肿瘤分期的增加而增高，在癌症患者的血液样本中预测的概率显著高于健康对照组和良性食管疾病组；同时在训练集和测试集里的分类准确性（AUC: 96.3% 和 93.2%）高度一致，可有效区分入组人群类型；
2. 训练集敏感性和特异性分别为86.0%和94.0%；测试集敏感性和特异性分别为76.2%和94.1%；
3. 血液中的肿瘤信号伴随癌症分期的增加而增强，敏感性也随肿瘤分期的增加而增高，测试集中早期（0-II期）和晚期（III-IV期）的敏感性分别为65.4%和93.8%。

图4. 训练集（左）和测试集（右）的敏感性和特异性结果

通过对上述所有人群的综合分析，健康个体的综合特异性为95.2%，良性食管疾病的综合特异性为80%，这些结果初步显示了液体活检甲基化检测在食管癌早筛早检中具有较强的可行性。

前瞻性独立验证，

再次彰显ELSA-seq用于食管癌早检的潜力

为了进一步验证模型性能，研究进行了前瞻性、单盲试验，分别纳入了2020年2月至2020年5月期间，郑州大学第一附属医院食管癌患者和重庆大学肿瘤医院健康对照组的血液样本进行独立验证：

• 验证集的敏感性和特异性分别为74.7%和95.9%；
• 食管癌早期（0-II期）和晚期（III-IV期）的敏感性分别为58.8%和100.0%；

图5. 独立验证集结果

本研究为无创cfDNA甲基化检测在未来食管癌早检的应用奠定了基础，再一次证明ELSA-seq技术在多癌种早期检测中具有广阔的应用前景。在2020年的ESMO Asia大会口头报告中，来自复旦大学附属中山医院的研究者汇报了ELSA-seq技术在肺癌、食管癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌和卵巢癌六个癌种中的验证数据，整体敏感性和特异性分别为80.6%和98.3%（验证集），并且呈现了高达82%准确性的组织溯源能力。在此基础上，两个前瞻性早检多癌种万人研究“PREDICT”和“PRESCIENT”已前后开启，正在有序进展中。

科技的进步不是一蹴而就，在泛癌种早检这个开创性的技术临床应用探索的过程中，燃石医学历经5年时间，从技术路线选择、技术研发、技术迭代、前瞻性万人临床试验的启动，每一步都怀揣着坚定且严肃的心态，而每一次数据的公布和研究的推进也离不开中国医学从业者对癌症早检的信心和期待。未来，燃石期待与医学界的专家们一道努力，一如既往不遗余力地推动癌症早检产品的研发和落地，为癌症患者大幅延长生存时间和提高生命质量贡献中国科技创新的力量。

参考文献：

[1] Bray F, et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a cancer journal for clinicians. 2018;68(6):394-424.

[2] Siegel RL, et al. Cancer statistics, 2020. CA Cancer J Clin. 2020; 70(1):7-30.

[3] Malhotra, G. K. , et al. Global trends in esophageal cancer. J. Surg. Oncol. 2017, 115, 564-579.

关于燃石医学

燃石医学（纳斯达克代码：BNR）成立于2014年，公司使命为“用科学守护生命之光”，专注于为肿瘤精准医疗提供具有临床价值的二代基因测序（NGS）。公司业务及研发方向主要覆盖：1）基于NGS的肿瘤患病人群检测，累计检测样本超过30万例，在中国拥有领先的市场份额；2）全球抗肿瘤药企的生物标志物和伴随诊断合作；3）基于NGS的癌症早检。燃石医学于2018年7月获国家药品监督管理局（NMPA）颁发的中国肿瘤NGS检测试剂盒第一证，在体外诊断领域具有里程碑式意义。位于中国广州的实验室通过广东省临床检验中心颁发的“高通量测序实验室”技术审核，获得美国CLIA和CAP实验室质量体系资质认证；位于美国加利福尼亚州的实验室也已获得CLIA和CAP实验室质量体系资质认证。公司将继续致力于开发创新可靠的NGS检测产品，推动肿瘤精准医疗领域的发展。