癌症的早期发现，为患者提供了更有效的治疗甚至治愈的机会。近年来随着二代基因测序的迅速发展，基于液体活检、循环游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）甲基化检测的多癌种早检技术，使得通过一管血实现“癌症信号”分析、“癌变器官”溯源成为可能，有望成为目前权威医学指南推荐的癌症筛查手段的有效补充。

在2022年4月8-13日美国癌症研究学会（AACR）年会和6月3-7日美国临床肿瘤学会（ASCO）年会期间，燃石医学六癌种早检临床研究THUNDER（THe UNintrusive Detection of EaRly-stage cancer, NCT04820868）最新的分析性能数据和临床性能数据先后以壁报（poster）的形式发表。这是燃石医学继2021年在Nature Biomedical Engineering（IF=25.671）发表自主研发的无创甲基化检测技术ELSA-seq技术原理之后^[1]，第一次系统性地展示ELSA-seq在六种癌症中的分析性能表现，也是在历时4年的THUNDER研究画上句号后，对其临床性能的一次全面总结。

燃石医学2022年AACR poster

燃石医学2022年ASCO poster

AACR：ELSA-seq分析性能数据

研究方法

样本投入量评估：按5 ng-30 ng的DNA投入量浓度梯度，在48个样本中评估甲基化信号的一致性；

分析敏感性：通过自制甲基化参考标准品（Methylation Reference Standards，MRS），对656个样本进行变异等位基因频率（variant allele frequency，VAF）分析，以定义最低检测限（LOD）。相关结果使用ddPCR进一步验证作为独立证据；

分析特异性：通过120名健康人血浆样本检出的真实阴性率评估分析特异性；

可重复性与再现性：对多个试剂批次、仪器、操作人员和天数处理的378个血浆样品进行了评估；

结果稳定性：使用可能存在于血浆样本中的常见干扰物质（如血红蛋白、胆红素、甘油三酯和基因组 DNA）对84个人造样本结果进行评估。

THUNDER研究的分析性能验证流程

主要研究结果

在分析敏感性研究中，所有样本均采用最低投入量（5ng），并在99%和95%两种锁定的特异性阈值下进行分析（以下分别缩写为MCDBT1和MCDBT2）对不同肿瘤占比（体现为VAF）的甲基化标准品进行检测限（LOD95）评估。结果发现，在6种癌症（肺癌、食管癌、结直肠癌、肝癌、胰腺癌和卵巢癌）中，ELSA-seq可以稳定检出低至0.02%的LOD95，不同癌种的LOD95在0.02%到0.11%之间（见下图，蓝色和红色分别对应MCDBT1和MCDBT2，即模型在99%和95%的训练特异性阈值下的表现）。

此外，本研究在 120 例年龄匹配的健康样本中分别检测到0例（MCDBT1）和2 例（MCDBT2）假阳性，对应的分析特异性分别为100%（95%CI：97.0-100%）和 98.3%（95%CI：93.5-99.7%）；所有检测结果在多个试剂批次、仪器和操作员之间达到了100%的可重复性和100%的结果可再现性；此外，所有常见干扰物质均未对检测结果造成影响，结果稳定性亦达到100%。

ELSA-seq的分析性能结果表明，作为一种检测血浆中痕量肿瘤甲基化信号的技术，其性能兼具有高度的敏感性、可重复性和稳定性，为下述临床性能的研究奠定了扎实的基础。

ASCO: ELSA-seq临床性能数据

研究方法

THUNDER研究是一个多中心病例对照研究，曾在2020年的欧洲肿瘤学会亚洲分会场（ESMO-Asia）会议上，燃石医学公布过中期研究结果。此次ASCO会议前，THUNDER研究已经全面完成；通过严谨的“三段式”设计，即回顾性训练阶段、验证阶段和前瞻性独立盲法验证阶段，忠实客观地展示了ELSA-seq的临床性能。

在回顾性研究阶段，研究纳入了来自 1,693 名参与者（癌症：n=735；非癌症：n=958）的血浆样本，其中约3/4样本用于构建模型和选择阈值（癌症：n=399；非癌症：n=626），构建出不同敏感性、特异性的多癌种早检模型（multi-cancer detection blood test, MCDBT-1/2），适用于不同的风险人群；大约1/4样本，用于独立评估模型的性能（癌症：n=301；非癌症：n=123）。随后，在前瞻性研究阶段，研究纳入了和训练阶段不同的多个独立中心的样本，通过前瞻性收样、年龄匹配，最终473例癌症和473例非癌症样本进入了盲法分析，旨在对高维建模的稳定性进行更加严格的考验。

最后，本研究还通过流行病学模型对ELSA-seq应用于六种癌症的生存获益进行了模拟，该模型利用中国癌症发病率、诊断时癌症分期的分布情况、五年生存率和肿瘤进展速度等数据，来推断ELSA-seq在适用人群场景下，所能带来的分期前移（stage-shift）和生存获益，讨论肿瘤早检在群体层面的临床意义^[2]。

主要研究结果

1. Panel设计

通过公共数据库以及燃石医学内部数据库（癌症：n=249；非癌症：n=288），共获得了161,984个和六种癌症及器官相关的CpG位点。

如上图所示，利用上述癌症特异性甲基化定制panel进行癌症信号检测（t-SNE方法可视化），panel可以显著区分来自于癌症的信号和非癌信号（上图A）；同时，检测出的癌症信号具体来源于哪一器官也可以被panel鉴别（t-SNE方法可视化，上图B）。

2. 敏感性（Sensitivity）和特异性（Specificity）结果

本研究发现，经过模型训练、验证和独立验证，在最终的盲法独立验证队列中MCDBT-1表现出69.1%的综合敏感性和98.9%的综合特异性（下图）。由于血液中的肿瘤丰度（tumor burden）依然是I/II期敏感性的主要限制因素，同时不同癌种在不同分期时血液肿瘤丰度强度有显著差异，从下图我们可以看到在敏感性结果方面，不同癌种存在差别。比如，肝脏作为供血器官天然向血液中掉落的游离DNA较多，其整体敏感性和特异性显著优于其他癌种。相比较之下，MCDBT-2的特异性略低于MCDBT-1，为95.1%，但敏感性高于MCDBT-2，为75.1%。

在多癌种早检液体活检产品的研发过程中，敏感性和特异性往往是需要平衡的天平两端。对于无症状的平均风险人群来说，高特异性对多癌种筛查非常重要，否则，相当数量的健康个体将被诊断为假阳性，造成不必要的后续检查和焦虑情绪；另一方面，对于具有特定高风险因素的人群，高敏感性则特别重要，否则会造成一定程度的漏检。因此从社会经济学的角度，如何权衡两者显得至关重要。因此，本研究试图通过MCDBT-1/2模型对特异性和敏感性的分别侧重，为未来研发方向进行一些初步的探索。

3. 组织溯源准确性

在本研究中，ELSA-seq显示出优越的组织溯源（定位癌变器官）能力。在MCBDT-1中：

• 在训练集和验证集中，预测准确率为89.7%（训练集）和82.8%（验证集）；
• 在盲法独立验证队列中，达到了83.2%的组织溯源准确性。

MCDBT-2同样具有较高的组织溯源的准确性，在独立验证队列中，达到了79.4%的组织溯源准确性。

4. 预估敏感性和潜在的临床效益

为了进一步评估MCDBT-1/2 模型的临床潜能，我们利用中国癌症发病率和癌症诊断时分期分布情况的数据，模拟MCDBT-1/2在真实世界中的潜在获益。MCDBT-1/2根据发病率调整后的敏感性分别为70.6%和77.5%。在模拟不同的肿瘤生长速度下，MCDBT-1能够带来38.7%-46.4%的分期前移（从III-IV期前移到I-II期），同时，能够使五年生存率相对提高33.1%-40.4%。

总结

THUNDER研究为无创cfDNA甲基化检测在未来在更多癌种中的应用拓展奠定了基础，再一次证明ELSA-seq技术在多癌种早期检测中具有优异的性能和广阔的应用前景。目前，基于既往研究结果，燃石医学已先后启动了中国首个超万人、多癌种前瞻性早检临床试验项目PREDICT以及首个基于液体活检多组学的前瞻性泛癌种早检万人研究PRESCIENT，同时正在筹备多癌种液体活检用于无症状癌症高风险人群癌症筛查的前瞻干预性研究PREVENT。未来，燃石期待与医学界的专家们一道努力，推动中国多癌种早检产品的临床验证和开发，以期把更多的癌症拦截在早期，从而改善癌症患者生存率，减轻社会经济负担。

参考文献

[1] Liang N, Li B, Jia Z, et al. Ultrasensitive detection of circulating tumour DNA via deep methylation sequencing aided by machine learning. Nat Biomed Eng. 2021 Jun;5(6):586-599.

[2] Hubbell E, Clarke CA, Aravanis AM, et al: Modeled Reductions in Late-stage Cancer with a Multi-Cancer Early Detection Test. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 30:460-468,2021.

关于燃石医学

燃石医学（纳斯达克代码：BNR）成立于2014年，公司使命为“用科学守护生命之光”，专注于为肿瘤精准医疗提供具有临床价值的二代基因测序（NGS）。公司业务及研发方向主要覆盖：1）肿瘤患病人群精准医学检测；2）全球抗肿瘤药企的生物标志物和伴随诊断合作；3）多癌种早检。燃石医学于2018年7月获国家药品监督管理局（NMPA）颁发的中国肿瘤NGS检测试剂盒第一证，在体外诊断领域具有里程碑式意义。位于中国广州的实验室通过广东省临床检验中心颁发的“高通量测序实验室”技术审核，获得美国CLIA和CAP实验室质量体系资质认证；位于美国加利福尼亚州的实验室也已获得CLIA和CAP实验室质量体系资质认证。公司将继续致力于开发创新可靠的NGS检测产品，推动肿瘤精准医疗领域的发展。