2019年5月16-19日，第二届全球分子病理学大会在香港召开。本届大会特定主题 “基于证据的精准医学”，推广“精准医学在考虑患者个体基因、环境和生活方式的个体差异时，必须坚持循证医学的原则才能实现”的正确理念。

响应大会号召并呼应大会主题，燃石研发团队为参会专家展示了朗克^®试剂盒和ctDNA检测参考品的相关研发数据，正是基于这些研发数据的日益积累和千锤百炼，燃石才得以为临床提供准确可靠的肿瘤NGS检测产品。

Poster 1 : 非小细胞肺癌朗克^®试剂盒的分析性能确认和临床确认

燃石朗克^®试剂盒用于定性检测非小细胞肺癌常见用药靶点，覆盖多种突变类型，包括单核苷酸突变（SNVs）、插入/缺失（InDels）、基因重排（Fusions）和拷贝数变异（CNAs）。

使用该试剂盒的检测流程为：采用RNA探针捕获技术，对从FFPE样本中提取的组织DNA，通过片段化、加接头和PCR等步骤制备全基因组预文库；用带有特定序列的RNA探针与预文库杂交，特异性地捕获人类基因组中目标基因的部分外显子与内含子区域；用链霉亲和素磁珠富集被探针捕获的DNA片段，富集的DNA作为模板扩增得到最终的文库；上机测序；数据分析得出最终的检测结果。

为确保检测结果的可靠性并可应用于临床，燃石朗克^®试剂盒在完成开发后，进行了严格的分析性能确认以及临床确认。

分析性能确认

1. 准确性：

使用朗克^®试剂盒对45例非小细胞肺癌患者临床样本进行检测，同时采用已验证过的ddPCR和FISH进行检测，统计试剂盒的灵敏度和特异性。结果表明，本试剂盒的灵敏度和特异性均为100%。

2. 分析特异性-交叉污染研究：

使用朗克^®试剂盒对交叉排列的非小细胞肺癌患者阳性样本和阴性样本进行检测，其中阳性样本中包含突变频率较高的突变，评估在实际检测流程中检测结果是否会受到临近样本的影响。结果表明，无任何交叉污染出现。

3. 分析特异性-干扰物质研究：

评估实验室常见干扰物质对朗克^®试剂盒检测性能的影响。本研究在商业化DNA中添加6种实验室常见的干扰物质，并以未加任何干扰物质的DNA作为对照，包含点突变（SNVs）、插入/缺失（InDels）、基因重排（Fuions）和拷贝数变异（CNAs）多种突变类型。结果表明，添加干扰物质与未添加干扰物质表现一致，在实际检测过程中朗克^®试剂盒不会受到该干扰物质影响。

4. 分析灵敏度：

使用朗克^®试剂盒检测包含不同突变类型的标准品DNA，且每种突变类型包含多个突变频率梯度(SNVs和InDels：5%、2%、1%，基因重排：8%、4%、2%，拷贝数变异：5、3、2.5)，重复检测20次，采用Probit分析，最终确认在标准检测流程下本试剂盒对不同突变类型的最低检测限。

5. 精密度（可重复性、再现性）：

评估不同操作人、试剂批次、操作时间对朗克^®试剂盒检测结果的影响。结果表明，不同的操作条件对本试剂盒的检出结果无影响。

临床确认（进行中）

朗克^®试剂盒的临床确认过程仍在进行中，我们对其中一个临床试验点的阶段性结果进行了展示（纳入分析318个样本）。经统计分析，阳性符合率为100.00%（0.982, 1），阴性符合率为95.6%（0.901, 0.986），总符合率为98.4%（0.964, 0.995）；使用SPSS进行Kappa检验，Kappa值为0.965（p＜0.001），评价产品和对比方法的检测结果一致性较好。

本研究表明，朗克^®试剂盒检测结果准确可靠，可以用于临床非小细胞肺癌患者的检测。

Poster 2 : ctDNA检测方法开发、性能确认和质控的参考品研发

液体活检是癌症患者临床检测的一种重要检测手段。然而，受现有的方法限制，缺少适合的参考品，在从提取到报告结果过程中监控ctDNA检测方法的开发、性能确认以及质量控制。混合肿瘤细胞系DNA是现有参考品制备的主要办法，然而，肿瘤细胞系经常伴随着核型异常，且含有众多未知的基因突变，作为参考品，这给ctDNA检测方法的开发和性能确认等环节都带来困扰。

因此，燃石开发了一种新的方法，在使用最少的细胞系材料，并保留天然酶切DNA片段的情况下，制备出近似于天然cfDNA的参考品，涵盖8个基因，包括SNV/Indel/Fusion/CNV突变类型的12种位点，用于ctDNA检测流程开发、性能确认和检测过程中的质量控制。

DNA片段化方法选择

我们比较了常见几种cfDNA参考品的制备方法，最终选择方法四制备背景cfDNA，因其片段分布与真实的cfDNA最相似，且有较高的类似于自然cfDNA的建库转化效率。

Table 1 核心生信指标

参考品制备及验证

向方法4制备的背景DNA中加入含有预期突变的DNA片段，获得含有预期突变类型和突变频率的ctDNA参考品，用ddPCR对每个突变及其突变频率进行确认。

用上述流程制备了含有12个突变的多突变ctDNA参考品，其中对于SNV/Indel/Fusion而言，目标突变频率为2%，对于CNV而言，目标拷贝数为5。使用30 ng ctDNA参考品构建NGS文库，使用燃石朗清^®检测，与ddPCR进行结果比对，两者对参考品VAFs的检出结果比较接近（表2）。

结论

• 燃石自主研发的参考品制备方法可以较好地模拟真实ctDNA的片段分布，且有较高的建库转化效率。
• 该方法制备的参考品可以减少验证范围外或范围内的不确定突变，并且实现供应的可持续性，可以做为ctDNA检测方法开发、性能确认和质量控制的参考品。

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